Determinação da pureza e heterogeneidade da proteínas com eletroforese capilar em gel e focalização isoelétrica capilar

INTRODUÇÃO

Anticorpos, terapias baseadas em proteínas e outras proteínas recombinantes são produtos finais na indústria biotecnológica e farmacêutica. A determinação de sua pureza, estabilidade e heterogeneidade é de extrema importância, já que modificações pós-traducionais, bem como processos de degradação, podem alterar drasticamente a atividade biológica dessas proteínas.

MÉTODO DE MEDIÇÃO

Para determinar a pureza e heterogeneidade das amostras de proteína, dois métodos baseados em capilares são propostos - eletroforese capilar em gel (CGE) e focalização isoelétrica capilar (CIEF). O primeiro é aplicado quando as proteínas que diferem na massa molecular devem ser resolvidas. Este último é aplicado quando as proteínas ou as proteínas que exibem massas moleculares quase idênticas, mas diferem nas cargas líquidas. Na CGE, o capilar é preenchido com uma solução de polímero tamponado. Antes da análise, a amostra de proteína é desnaturada na presença de SDS por aquecimento sob condições redutoras (com agente redutor adicionado) ou não redutoras. Após o resfriamento rápido, a amostra é injetada, é aplicada alta voltagem e as proteínas começam a migrar através da solução de polímero.

Semelhante à eletroforese em gel de SDS em uma placa, as proteínas são separadas em um capilar de acordo com suas massas moleculares devido a um efeito de peneiramento da solução de polímero capilar. Proteínas que diferem em até 4% em massa molecular podem ser resolvidas. No CIEF, todo o capilar é preenchido com uma mistura de amostra de anfólito à base de polímero. No primeiro estágio, denominado focalização, é aplicada alta voltagem, que resulta em uma formação de gradiente de pH e focalização de proteínas em zonas estreitas de acordo com seus valores de pI (onde suas cargas líquidas são iguais a zero). No final desta fase quase não há qualquer movimento no capilar e a corrente é de cerca de zero.

Durante o segundo estágio, denominado mobilização, o frasco de saída é substituído pela solução de mobilização, a alta tensão é aplicada novamente e as zonas focalizadas começam a se mover em direção ao ponto de detecção. Dependendo dos anfólitos selecionados, as isoformas de proteínas e proteínas que diferem em até 0,04 pI de unidade podem ser resolvidas e quantificadas. Para ambos os métodos existe uma regressão linear, refletindo a dependência do log do peso molecular das proteínas (para CGE) ou seus valores pI (para CIEF) no tempo de migração. Isso é usado para determinar os dois parâmetros das proteínas desconhecidas, adicionando os marcadores correspondentes à solução da amostra.